第一章 未來醫學的新希望-外泌體

第一節 小囊泡大學問
外泌體(Exosomes)近年成為國內外醫療產業的焦點，由於它具有比傳統幹細胞更多的優勢，使它成為未來醫療科技的新主流，從癌症、神經系統、呼吸系統、泌尿系統等多項疾病檢測治療到成為中西藥的載體、保健食品、護膚保養品，外泌體都能達到相當成效，隨著更多資金和人力投入的研發，儼然成為未來醫學的新希望。

外泌體的定義
這個主導未來醫藥產業的新成份―外泌體，對一般大眾尚屬陌生，到底什麼是外泌體呢?外泌體是由細胞內多囊體(multivesicular body，MVB) 與細胞膜融合後，釋放到細胞外基質中的一種直徑約30-150奈米的胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)。簡單說，外泌體是屬於一種包含複雜的去氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)、訊號核糖核酸(messenger Ribonucleic acid， mRNAs)、小分子核糖核酸(micro Ribonucleic acid ，miRNAs)、熱休克蛋白90(Heat shock protein 90，HSP90) 和熱休克蛋70(HSP70)等以及蛋白質的小囊泡，可作為訊號分子的載體，促進蛋白質、脂質、mRNA、miRNAs和DNA的傳輸與疾病的發展，參與生理和病理過程的訊號傳遞，外泌體組成的成份和功能決定於分泌的細胞種類，可以反應當時個人生理病理狀態和細胞的微環境(microenvironment)影響。
外泌體是科學家在研究網織紅細胞(Reticulocyte)轉變成熟紅細胞過程時發現，經過多年研究後，學者又發現除了網織紅細胞以外，T細胞、B細胞、血小板、樹突細胞(Dendritic Cell，DC)、肥大細胞(mast cell)、血細胞及上皮細胞、腫瘤細胞在正常及病理狀態下都可分泌外泌體，被分泌出的外泌體會進入人體血液、唾液、尿液、腦脊髓液及乳汁等體液中，透過循環系統到達其他細胞與組織，產生遠端調控作用。
外泌體的具體形成機制，目前不是十分清楚，但有研究學者認為，不同類型的細胞形成外泌體的過程可能大同小異。細胞通過內吞作用(Endocytosis)，產生了小囊泡，小囊泡融合形成早期核內體(early endosome)，並逐漸變為晚期核內體(late endosome)，隨著胞質內miRNA、酶(Enzyme)分子、熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)等一些物質的進入，晚期核內體會產生很多小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，並逐漸演變成多泡體，當這些小囊泡被釋放到細胞外，便形成外泌體。

外泌體的組成
外泌體由蛋白質、核酸、脂質組成，科學家從286項研究發現外泌體含有41860種蛋白質、2838種microRNA、3408種mRNA，常見的細胞質蛋白是Rabs蛋白，屬於鳥苷三磷酸(Guanosine triphosphate)家族的一種，可以調節外泌體膜與受體細胞的融合。

蛋白質有以下幾類：
(1)與生物發生機制有關：例如：膜蛋白和Rab蛋白，可促進多囊體與細胞膜的融合及外泌體的釋放；Tsg-101及附屬蛋白質Alix參與內體蛋白分選轉運裝置(endosomal sorting complexes required for transport ，ESCRT)過程，促進內體膜的凹陷。
(2)含有參與抗原呈遞的蛋白質，如：分化簇1(cluster of differentiation1，CD1)、第一型主要組織相容性複合物(major histocompatibility complexⅠ，MHC-Ⅰ)、和第二型主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ)，在免疫調節中發揮重要作用，MHCⅠ還參與向T細胞呈遞抗原的生理過程。外泌體表面存在熱休克蛋白，如HSP70和HSP90，促進了抗原肽與MHCⅠ及MHCⅡ的結合。
(3)含有信號轉導蛋白：如G蛋白和蛋白激酶。
(4)含有蛋白水解酶，顯示外泌體能夠促進細胞轉移。
(5)含有細胞質微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白，目前未發現外泌體含有與內質網、高爾基體(Golgi apparatus)和細胞核相關的蛋白質。
(6)特定腫瘤細胞分泌特定的蛋白質：例如：腸胃道間質瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)分泌的外泌體富含特定蛋白質可成為診斷標誌物，包含：KIT、CD34、ANO1、PROM1、PRKCQ、ENG。

核酸
外泌體含有大量核苷酸，目前已經發現DNA、RNA、miRNA及非編碼核糖核酸(non-coding RNA，ncRNA)等。特性如下：
(1) 在外泌體中mRNA為功能性RNA，可傳輸到目標細胞後可以被轉化成蛋白質外泌體中的miRNA，如let-7、miR-1、miR-15、miR-16、miR-151和miR-375在血管新生、胞吐作用(Exocytosis)、腫瘤發生等過程中發揮重要作用。
(2)外泌體富含腫瘤轉移有關的miRNA，如：來自於乳腺癌細胞系的人類正常乳腺細胞10A(Michigan Cancer Foundation10A，MCF-10A)和轉移性乳腺癌細胞MDA-MB-231 (MD Anderson-Metastatic Breast-231)的外泌體富含miRNA-105，可減少內皮細胞中ZO-1基因的表達，促進乳腺癌向肺和腦的轉移機率。
(３)外泌體中的miR-21和miR-29a可作為配體與免疫細胞受體(Toll-like receptors)結合啟動免疫細胞。
(4)外泌體miRNA可作為生物標誌物輔助疾病的臨床診斷。例如:let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a可作為診斷結腸直腸癌的生物標誌物、miR-21和miR-181a-5p可以判別甲狀腺乳頭癌(Papillary thyroid cancer)及濾泡性甲狀腺癌(Follicular Carcinoma)；miR-1290和miR-375可用作診斷前列腺癌預後的生物標誌物。

脂質
外泌體脂質成分包括：鞘磷脂(Sphingomyelin)、膽固醇、神經節苷脂GM3 (ganglioside)、飽和脂肪酸、磷脂醯絲氨酸(Phosphatidylserine)和神經醯胺。與其它來源細胞的細胞膜比較，外泌體膜表面的磷脂醯膽鹼(Phosphatidylcholine)和二醯基甘油(diacylglycerol)含量降低，但表面富含磷脂醯絲氨酸，有利於受體細胞內化，在生物功能方面發揮重要作用。

外泌體的分類
細胞外囊泡（EV）是細胞主動釋放的奈米級囊泡，根據來源、大小與生物學特性主要分為三類：外泌體、微囊泡、凋亡小體。
外泌體根據是否經過人工修飾可分為天然外泌體和工程外泌體。天然外泌體另可分為動物源性外泌體和植物源性外泌體，不同來源的外泌體各有不同用途和特性，應用在不同領域：
(1) 工程外泌體：
以基因工程和化學方法改造的外泌體，大都可用於藥物靶向遞送。優點為低毒性、低免疫原性和高穩定性，有望用於多種疾病的無細胞療法。有研究指出，將外泌體中裝載抗癌藥物(5-FU)以及基因片段(miR-21i)治療結直腸癌，一方面降低癌症抗藥性，一方面減少癌細胞增殖，加速癌細胞凋亡。雖尚處實驗階段，但仍為外泌體的治療方向帶來一線曙光。
(2) 動物源性外泌體：
可區分為正常外泌體和腫瘤外泌體，前者來自體液和細胞所分泌的外泌體，應用層面寬廣；後者來自腫瘤細胞可運用在癌症檢測治療。
(3) 植物源性外泌體：
從植物細胞中分離出的類外泌體奈米顆粒(plant exosome-like nanovesicles，PELNVs)有與哺乳動物細胞相似的特性和分泌模式，相較動物來源和人工合成的奈米囊泡，PELNV在藥物傳遞上不管是生物相容性、穩定性、體內分佈、延長半衰期和細胞內化等方面都表現出顯著的優勢。另外還具有體積小、組織穿透性強等優點，在不同酸鹼度和溫度下能維持較好的理化穩定性，成為有效的藥物載體，具有降低肝損傷和腸道疾病的作用。

醫藥保健新契機 應用層面廣
外泌體的廣為應用是近10年來的醫學新契機，學者發現外泌體在很多生理病理上有著重要的作用和影響，主要集中在腫瘤轉移、腫瘤免疫、診斷、心血管、幹細胞方面、組織損傷的修復、神經退化性疾病、腦與脊髓創傷、中風、學習障礙、巴金森氏症、阿茲海默症、心肌梗塞、肌肉萎縮症等疾病。外泌體的內含物通常可反應來源組織的疾病狀態，研究人員發現腫瘤來源的外泌體包含眾多能夠引發腫瘤轉移的因子，透過外泌體表面所含蛋白抗原(proteantigen)的分析，未來將是監測疾病發生、演變以及確定治療方法的主要途經。
幹細胞療法曾掀起熱潮，但外泌體的特性與優勢讓專家學者更看好它勝於幹細胞，主要是它具有抗發炎、好保存、分子小、與其它細胞相容的多種優點，使得國內外醫學專家紛紛投入外泌體的研究與商品開發。除此之外，外泌體並可應用於護膚品與保健食品，是未來不可忽視的商機。由於外泌體具有良好的再生與修復效果，不僅在臨床上用於燒傷、皮膚潰瘍、創傷等受損皮膚的修復治療，並且在改善膚質、修復衰老皮膚等也有功效。
研究發現，外泌體參與皮膚生理及病理的過程，調節皮膚微環境中促炎細胞因子分泌，促進皮膚缺損處血管新生及膠原蛋白沉積，以及調節皮膚纖維細胞增殖分化，促進創傷的癒合、抑制疤痕的形成等，應用於護膚美容產品上，將是愛美女士的福音；而外泌體保健食品，更被視為是市場上耀眼的明日之星，從醫藥保健到美容護膚，可以預期外泌體將對產業帶來革命性的影響與巨大貢獻。

第一章 未來醫學的新希望-外泌體

第一節 小囊泡大學問
外泌體(Exosomes)近年成為國內外醫療產業的焦點，由於它具有比傳統幹細胞更多的優勢，使它成為未來醫療科技的新主流，從癌症、神經系統、呼吸系統、泌尿系統等多項疾病檢測治療到成為中西藥的載體、保健食品、護膚保養品，外泌體都能達到相當成效，隨著更多資金和人力投入的研發，儼然成為未來醫學的新希望。

外泌體的定義
這個主導未來醫藥產業的新成份―外泌體，對一般大眾尚屬陌生，到底什麼是外泌體呢?外泌體是由細胞內多囊體(multivesicular body，MVB) 與細胞膜融合後，...

跨領域合作，共同提升生醫的發展
----莊銀清醫師．講座教授

行醫四十年來，我最主要的專科是感染症，個人感染症的醫學訓練是在臺北榮民總醫院，訓練完成後到臺南成功大學醫學院附設醫院擔任感染科主治醫師，對感染症的臨床、教學、研究方面開始產生濃厚的興趣。在擔任感染科醫師期間，除了診治一般的感染者之外，其中有很大比例是所謂的免疫力低下的患者，特別是癌症患者會有各式各樣的感染，所以在臨床經驗中可以產生很多的研究題材。
後來，我有機會到柳營奇美醫院擔任院長的職務，服務時間長達七年半。奇美醫院是一個相當特殊的醫院，除了各科別完整，最特別的是有來自全國的各式各樣的癌症病人來到這裡治療。我注意到這些癌症病人，除了一般的常規療法外，也都會去嘗試幹細胞或是免疫細胞治療，讓我發現新型態的癌症療法值得發展研究，所以我就在全國各地幫忙做整合幹細胞，還有研究細胞治療。
很幸運得到醫院一位董事的資助經費，在研究細胞治療過程中，我接觸到外泌體的領域，覺得它應用範圍層面非常廣泛，於是對外泌體產生興趣，開始查閱大量國外期刊文獻，得知外泌體許多的神奇功能，更肯定外泌體對未來醫療產業將會產生革命性的影響。
外泌體目前是一個嶄新的醫療成分，不論是細胞增生、修復損壞的細胞到抗衰老，都可發揮強大的作用。但臺灣社會大眾對外泌體是相對陌生的，所以希望藉由這本書籍的出版發行，可以讓普羅大眾認識外泌體。
說到外泌體，具有非常多令人驚豔的功能，它有細胞跟細胞之間傳遞的物質特性，當身體的器官出了問題，它就會傳遞出生病的訊息出來，讓患者可在早期就可獲得正確的病症診斷，不致延誤病情；同時外泌體在治療上也可扮演重要的關鍵角色，最重要的是外泌體可做為藥物載體，所以外泌體最重要的三大角色就是：診斷、治療、藥物載體。
在臺灣，外泌體還是一個新穎的題材，不管在研究或是開發應用在產業上，尚有很大的努力空間。由於外泌體可以觸及相當多領域，發展前景不可限量，我相當看好外泌體將是未來醫療的新希望，值得科學界、醫學界、生技界和政府單位，投入更多人力和資金研發，不僅可以提升國內生醫的發展，更能造福廣大的人群。
因此，我起心動念，決定將外泌體的研究編撰成書籍。藉由這本書籍，我希望讓讀者對外泌體有基本的認知和了解，同時也希望讓往後的醫學界或學術界能延續外泌體的研究與發展，為臺灣的外泌體科學邁進一小步。最後，能完成這本書，要感謝很多人。我要特別感謝陳振興博士與其團隊的合作，以及杜元坤院長的鼓勵，為我的研究上給予寶貴的經驗與意見，並讓陳振興博士及其團隊的研究和我的研究可以互相呼應，進而互相交流而結合在一起！這一本書的完成就是二個團隊合作的第一個具體成果，希望這樣的合作可以發揮一加一大於二的效果，進而更促進外泌體領域的進展！

外泌體將是未來生醫產業的明日之星
----陳振興醫師．醫學博士

十幾年前，我剛開始接觸到幹細胞的研究，在研究過程中了解到幹細胞在進化的過程中，會分泌一部分的外泌體。當年不管是醫療界或是生技界，對外泌體的知識還是相當有限，只把外泌體當做是幹細胞進化過程中的一個廢棄物。隨著時間的演變，經過多位學者專家的投入研究發現，外界對外泌體的認識愈來愈多，也才發現外泌體多項的強大的功能，所以我逐漸把重心從幹細胞轉移到外泌體研究。
外泌體可說是未來生醫產業的明日之星，但是對於普羅大眾來說，外泌體還是很陌生的成分，於是我興起寫書的想法，希望透過行業內的專家，將外泌體做有系統的介紹，來帶動臺灣對外泌體產業的重視，未來有更多的發揮的空間。
傳統藥物的載體大都是透過脂體來完成，但是脂體分子較大，所以進到細胞後，發揮的藥效有限；但是外泌體分子細小，具有精準、靶向性高的特色，所以藥物進到身體後，更能完整發揮藥效。再來過去我們知道幹細胞對組織細胞的修復功能強大，其中外泌體就是扮演了重要關鍵角色。
外泌體在未來醫療產業將會扮演一個非常重要的角色，從疾病的診斷到治療，世界多個國家都投入相當的資金與人力做研發，臺灣目前對外泌體的研究還在起步階段。所以這是我寫這本書的目的，一方面是讓社會大眾認識外泌體，另一方面給對這個領域有興趣的科研初學者，幫助他們能夠更做更深入的研究，讓這個產業有更多人加入，也希望政府有關單位能夠重視醫藥產業的扶植，透過這本書來讓官方決策人員做參考，讓他們能夠重視外泌體這個產業。
這本書從收集資料到撰寫得以完成，首先我要感謝與我共同執筆的莊銀清院長，他在繁忙的工作外，與我一起花了相當多時間和心力來投入，也感謝背後的書籍策劃小組，包括臺灣公司的玫玲、佑丞、雅玟、世賢、偉嘉、啟皓、容琦；中國大陸公司的彩虹、占奪、玉娟、淑真、又甄；也要特別感謝義大醫院的杜元坤院長給予這本書他的精心著作與非常多的專業建議，讓我受惠良多，讓這本書增加更多專業性和可看性。

跨領域合作，共同提升生醫的發展
----莊銀清醫師．講座教授

行醫四十年來，我最主要的專科是感染症，個人感染症的醫學訓練是在臺北榮民總醫院，訓練完成後到臺南成功大學醫學院附設醫院擔任感染科主治醫師，對感染症的臨床、教學、研究方面開始產生濃厚的興趣。在擔任感染科醫師期間，除了診治一般的感染者之外，其中有很大比例是所謂的免疫力低下的患者，特別是癌症患者會有各式各樣的感染，所以在臨床經驗中可以產生很多的研究題材。
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〔推薦文〕
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先進的醫療技術，須輔以先進的立法／蔡碧仲 法務部 政務次長
江山代有人才出，臺灣外泌體產業的先驅者／洪奇昌 前立法委員．醫師
前進健康臺灣／陳郁秀 前文建會主委．公視、華視 現任董事長
臨床與基礎醫學合作，打造國家生技產業／蘇慧貞 國立成功大學 校長
帶來跨界 Impact 的外泌體／李昆達 國立臺灣大學生化科技學系 教授

〔特邀專文〕
外泌體功能更勝幹細胞／杜元坤 高雄義大醫院 院長

〔作者序〕
跨領域合作，共同打造生醫的發展／莊銀清 醫師．講座教授
外泌體將是未來生醫產業的明日之星／陳振興 醫師．醫學博士

Chapter 1 未來醫學的新希望——外泌體
小囊泡大學問
■ 外泌體的定義
■ 外泌體的組成
■ 外泌線的分類
■ 醫藥保健新契機
外泌體功能
■ 參與細胞間訊息的交流
■ 調節免疫反應
■ 疾病診斷標記物
■ 藥物傳遞的載體
■ 修復受損細胞
外泌體的發現起源與發展歷史
■ 諾貝爾生醫學家的意外發現
■ 為治療癌症提供重要基礎
■ 戴上諾貝爾獎的光環
■ 多元及寬廣的應用層面
外泌體的研究近況
■ 細胞療法與法規現況
■ 臺灣的外泌體研究
■ 幹細胞外泌體於神經損傷治療的應用
■ 治療新行冠狀病毒肺炎所扮演的關鍵角色
解開外泌體奧祕的諾貝爾獎得主
■ 薛克曼——從遺傳學方法找到細胞內部蛋白質傳輸過程
■ 拉斯曼——SNARE決定囊泡錨點定位與融合
■ 居德霍夫——鈣離子觸發囊泡的融合
■ 各有所長，相輔相

Chapter 2 外泌體的培養及提取技術
外泌體的培養方法
■ 常見的細胞培養技術
■ 生產臨床級外泌體的可能性
常用提取方法
■ 差速離心法
■ 密度梯度離心法
■ 聚乙二醇（PEG）沉澱法
■ 免疫捕獲法（親和層析法、免疫磁珠法）
■ 尺寸排阻色譜法
■ 超濾法
■ 微流控晶片法
■ 切向流過濾法
■ 常見提取法優缺點比較對照表
外泌體的其他提取方法
■ 試劑盒提取法
■ 靜水過濾透析法
■ 非對稱場流分離法
■ 脂質奈米探針法
■ 其他提取方法優缺點比較對照表

Chapter 3 外泌體的鑑定及保存方式
常用外泌體鑑定方法
■ 電子顯微鏡技術（電鏡技術）
■ 免疫印跡技術
■ 流式細胞術
■ 奈米顆粒追蹤分析技術
■ 液相色譜–質譜聯用技術
■ 常見外泌體鑑定方法比較對照表
外泌體的保存方法
■ 常規保存條件
■ 如何保存不同來源的外泌體？
■ 凍乾技術的應用

Chapter 4 外泌體的功效及應用
呼吸系統疾病應用
■ 肺結核
■ 哮喘
■ 肺癌
■ 慢性阻塞肺疾病
■ 新型冠狀病毒肺炎
消化系統疾病應用
■ 胰腺癌的早期診斷曙光
■ 食道癌的早期診斷標誌物
■ 提升結直腸癌診斷技術
■ 胃癌診斷的新希望——CD97
■ MET蛋白在肝癌檢測上的研究
■ CTC於膽囊癌診斷
泌尿系統疾病應用
■ 急性腎損傷
■ 腎臟癌
■ 腎小球疾病
■ 腎小管疾病
■ 膀胱癌
■ 前列腺癌
■ 糖尿病腎病
■ 其他腎臟疾病
心血管系統疾病應用
■ 動脈粥狀硬化
■ 急性心肌梗塞
■ 高血壓
■ 心力衰竭
■ 心肌病
■ 細胞移植改善缺血後心功能
■ 觸發心臟保護作用
神經系統疾病應用
■ 幹細胞外泌體應用，讓肢體癱瘓不再是「不治之症」
■ 治療腦中風，有效改善神經功能恢復
■ 臍帶間充質幹細胞外泌體，有望改善阿茲海默症
■ 牙髓幹細胞外泌體，具治療帕金森氏症潛力
免疫系統疾病應用
■ 免疫細胞外泌體的調控作用
■ 自體免疫性疾病
■ 系統性紅斑狼瘡
■ 發炎性腸道疾病
■ 類風濕性關節炎
■ 第一型糖尿病
腫瘤治療應用
■ 在腫瘤分泌和轉移中扮演的角色
■ 癌症早期診斷的依據
■ 腫瘤因子外泌體快速檢測
■ 腫瘤免疫治療
■ 理想的藥物載體
骨科疾病治療應用
■ 骨細胞的調控與治療
■ 骨關節炎
■ 椎間盤退化症
■ 骨質疏鬆症
■ 骨折癒合
其他疾病應用
■ 女性生殖系統疾病
■ 人體免疫缺陷病毒疾病
■ 肥胖症
■ 特殊傳染病

Chapter 5 外泌體在保健食品的運用
植物外泌體
■ 結構組成
■ 運用在保健食品的優勢
■ 源自實用與藥用植物的不同功能

Chapter 6 外泌體在護膚產品的應用
幹細胞與植物細胞外泌體
■ 對於皮膚的抗老、再生活化功效
■ 天然的美白與抗發炎功效

Chapter 7 外泌體在藥物開發的應用
藥物載體功能的巨大潛力
■ 供體細胞選擇與藥物裝載方式
■ 藥物載體應用與疾病治療
■ 中醫藥的應用
■ 未來的挑戰與展望

Chater 8 外泌體在疾病診斷的應用
訊息分子傳達的重要訊息
■ 疾病診斷的生物標誌物
■ 疾病診斷中的應用
■ 臨床應用前景
■ 疾病診斷的臨床意義

Chapter 9 工業外泌體的生產方式
工業外泌體的生產方法
■ 3D細胞培養結合切向流過濾
■ 與GMP相容的生產方式
如何提高外泌體產量？
■ 細胞奈米穿孔法，提高產量與mRNA載藥量
■ CNP法生產載負目標mRNA的外泌體
■ 仿生外泌體奈米囊泡開發，提高一百倍產量
■ EXOtic高效生產定製化外泌體，治療怕金森氏症

Chapter 10 外泌體的市場發展情況
外泌體市場發展驅動因素
■ 外泌體在臺灣的發展
■ 外泌體的市場規模
■ 外泌體的市場趨勢
■ 外闢體的市場潛力
全球外泌體發展情況
■ Exosome Diagnostics
■ EvOx Therapeutics
■ Capricor Therapeutics
■ PureTech Health（PRTC）
■ Codiak Biosciences
■ ExoCoBio
■ Creative Medical Technology Holdings（CMTH）
■ Aegle Therapeutics
■ 二○三○年，市場規模將達二十二億八千萬美元

〔特邀刊文〕
■ 自人體嗅鞘細胞分離細胞外泌體增強神經幹細胞的生存能力
■ Extracellular vesicles isolated from human olfactory ensheathing cells enhance the viability of neural progenitor cells
〔附錄〕 中英文專有名詞對照表
〔參考文獻〕

〔推薦文〕
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〔特邀專文〕
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