名人推薦：王文竹（淡江大學化學系教授）

2008年諾貝爾物理桂冠
水母綠光點亮生命彩頁—繽紛奪目的螢光蛋白


吳益群　台大分子與細胞生物學研究所教授
蔣沆祥　台大分子與細胞生物學研究所博士


2008年10月，在眾人翹首引領之下，瑞典皇家科學院宣布2008年諾貝爾化學獎由日裔美籍科學家下村脩（Osamu Shimomura）、美籍科學家馬丁．查爾菲（Martin Chalfie）和華裔美籍科學家錢永健（Roger Y. Tsien）三人共同獲得，以表揚他們研究綠色螢光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的卓越成果。
GFP是一種螢光蛋白，在藍光或是紫外光的照射下，呈鮮綠色螢光，因此，科學家可利用GFP來觀察生物體甚至是細胞內的生物事件。例如，GFP可以用來觀察生物體內腫瘤的成長或是病原體的移動；GFP也可以用來偵測單一細胞內的胞器、染色體的變化，或是蛋白質的產生。換言之，當顯微鏡技術帶領人類遊覽細胞內的建築之美時，GFP可說是更忠實地呈現了內在的事件變化，讓我們更詳盡地了解生命現象的運作，或是疾病的產生機制。如此豐功偉業，讓GFP摘下諾貝爾化學獎的桂冠確是實至名歸。然而，到底GFP 是如何達成這個神奇的任務，讓我們得以窺探生物體內的祕密活動？讓我們話說從頭。

綠色螢光蛋白的誕生
諾貝爾獎得主下村脩，從1960年開始跟隨約翰森（Frank H. Johnson）研究水母，初衷十分單純——想要了解為什麼水母會散發漂亮的光芒。為了收集大量水母做研究，他常去海邊撈拾水母，有時甚至動員妻小一起幫忙收集。後來他專注研究一種學名為Aequorea victoria的水母；這種水母在北美西海岸隨洋流漂移，身體呈美麗的藍色，受到刺激時，其傘緣的發光器官（photoorgan）則會發出綠色螢光。
在收集到許多A. victoria後，下村脩將水母的傘緣割下，置於濾紙上，壓榨萃取其汁液。經過約莫一年的嘗試與努力，他成功地從這些汁液中分離出水母發光蛋白（aequorin），這種分子在與鈣離子並存時會發出強烈的藍光，也就是A. victoria呈藍色的原因。同時，他也分離出另一種讓水母產生綠色螢光的物質——GFP，這便是GFP的第一次破「水」問世。
之後數年，下村脩進一步研究出GFP在分子立體結構上，有一個特殊的發色團，這個特殊的球狀結構由三個胺基酸組成，在吸收藍光或是紫外光後會被激發，而散發出明亮的綠色螢光。這個發現大大顛覆了以往對發光蛋白的印象：大多數的發光蛋白都需要額外的輔助因子才能發光，如水母發光蛋白就需要有鈣離子的存在才能發出藍光。然而GFP只需要照射藍光或紫外光，就可以發出綠色螢光。也就是說，如果想利用GFP 的螢光觀測細胞內的變化，只要給細胞正確的激發光源，它就會給予想要的資訊，不需額外加入其他分子，也不必擔心會影響細胞的正常生理。
當時下村脩並沒有意識到GFP 的應用前景，對他來說，了解水母為何會發光而滿足他純粹的好奇心，就是一種莫大的幸福。但是正因為下村脩長期的熱情與執著，我們才有機會認識深藏在海洋生物體內的寶藏——GFP，使得後進有機會去應用這個神奇的綠色螢光蛋白。下村脩因此被譽為「生物發光研究第一人」。

綠色螢光蛋白嶄露頭角
在下村脩發現了GFP這個神奇的螢光蛋白後，馬丁．查爾菲首先將GFP應用在活體生物的觀測上。他的研究對象是線蟲Caenorhabditis elegans。C. elegans的成蟲僅有2公釐大，共有959個體細胞，但是「麻雀雖小，五臟俱全」，牠有許多在人類身上可以發現的細胞種類，有完整的組織及系統；更重要的是，線蟲與人類的基因體相似度高達40%，因此具有極高的研究價值。
線蟲的另一個研究優勢就是牠是透明的——我們可以直接在顯微鏡下清楚看到線蟲體內的所有細胞。馬丁．查爾菲在1977年師承Sydney Brenner（因開啟線蟲的研究領域，於2002年與John E. Sulston及Robert Horvitz共同獲頒諾貝爾生醫獎），開始線蟲神經系統的研究。最令他著迷的問題是線蟲對外界的觸覺反應：當我們用拔下的眼睫毛去輕碰線蟲的尾巴時，牠會快速地往前爬行；但若輕碰其頭部時，則會快速後退。
馬丁．查爾菲發現線蟲的觸覺主要來自6個觸感神經細胞的作用，雖然利用電子顯微鏡以及免疫螢光染色技術，已經可以清楚知道這6個神經細胞的位置與連結關係，但是這兩種顯微技術都必須犧牲線蟲，而且操作繁瑣，想要在活生生的線蟲體內直接觀察追蹤神經細胞，在當時根本就是天方夜譚。
在1988年美國哥倫比亞大學舉辦的學術演講中，馬丁．查爾菲知道了GFP，這讓他非常雀躍。由於GFP是生物體內自然產生的蛋白質，因此只要在特定細胞表現這種蛋白質，就有機會讓活細胞「發光」，如此就可以用來在活體內標記特定的細胞。當時馬丁．查爾菲就想到可以將GFP基因連接在他想研究的基因後面，再把這樣的DNA顯微注射到線蟲體內，這樣一來，GFP所發出來的綠色螢光就像一盞探照燈，指出蛋白質產生的時間跟位置。1992年，普瑞舍（Douglas Prasher）成功地複製出GFP基因，兩年後，馬丁．查爾菲將他的想法化為真實：他將GFP基因接在一個啟動子（promoter）後面，這個啟動子在線蟲的6個觸感神經細胞中會被啟動，並形成GFP分子，使得這6個特殊的神經細胞發出綠色光芒。
馬丁的這個實驗為GFP立下一個意義非凡的里程碑，因為這證明從水母身上分離出來的GFP基因，也可以在其他物種上正確地表現與摺疊，並發出綠色螢光。這對當時的研究來說是一大福音，因為在那時，若想要利用螢光顯色來研究特定蛋白質，研究人員必須將螢光化合物以人工的方法與蛋白質接合，再注射到細胞內，此流程需要高度專業的設備與操作技術，尤其對於複雜的多細胞生物來說，執行起來十分困難。
同時，螢光化合物通常具有毒性，而且每觀測一種不同的蛋白質，就必須重新進行蛋白質純化的步驟，更提高了繁瑣程度與難度。相較之下，利用啟動子來產生GFP的方式簡易許多，而且GFP對細胞也不具有毒性。因此，在馬丁．查爾菲發表這項研究的後續幾年內，利用GFP觀測細胞內蛋白質產生與變化的研究，如雨後春筍般出現。

蛋白質決定細胞的命運
為何觀測蛋白質的生成與變化是生命科學中的重要課題？因為生物體內有成千上萬不同種類的蛋白質，這些蛋白質各自執行不同的功能使細胞正常運作，也就是說，蛋白質幾乎掌控了細胞的命運。當有蛋白質發生異常時，細胞的運作就會出錯，疾病便隨之而來，這就是為何科學家急於了解各個蛋白質功能的原因。而每個蛋白質的產生，都需要經過基因上特定的啟動子啟動基因，轉錄合成mRNA，再轉譯形成蛋白質，這就是所謂的中心法則（central dogma）。
舉例來說，當你因為登山或其他原因，吸入的氧氣變少時，體內的缺氧誘導因子就會與紅血球生成激素的啟動子結合，開始製造紅血球生成激素的mRNA，然後轉譯形成紅血球生成激素，此激素可以促進紅血球的產生，最後使體內的攜氧能力提高，以適應氧氣較少的環境。如果我們在紅血球生成激素基因的DNA序列後面接上GFP基因的話，在一般氧氣充足的情況下，紅血球生成激素基因並不會表現，所以我們不會觀察到綠色螢光；但是當氧氣含量較低的時候，缺氧誘導因子與紅血球生成激素基因的啟動子結合，就會產生紅血球生成激素，此時我們將會看到這種蛋白質發出綠色的螢光。這樣的實驗策略，可以廣泛應用於探測各種細胞內的蛋白質變化，我們可以知道細胞在活體內移動的路徑，也可以知道在血管生成時，有哪些蛋白質會產生；我們甚至可以知道，當癌症產生時，有哪些蛋白質會大量地表現。

綠色螢光蛋白大放「異彩」
然而科學家並不滿足於現況。雖然我們已經可以觀測到細胞內的蛋白質了，但如果我們想要同時觀測兩種以上的蛋白質呢？這時如果兩者都是綠色螢光的話，我們勢必無法分辨它們。
錢永健為此提供了解決之道。早些時候，錢永健就已是螢光化合物的專家，他發明許多螢光化合物，用以偵測鈣離子的變化。他的研究也對GFP的發色團做了進一步的闡述，說明這個結構如何經由化學變化產生螢光，除此之外，他將238個胺基酸長度的GFP，利用基因工程的技術，在螢光蛋白中不同的胺基酸位置進行代換。藉由這個方式，他改造出螢光效果比GFP更強更穩定的EGFP（enhanced GFP）；同時，他也陸續發展出不同顏色的變種GFP，如青綠色、藍色和黃色等等。
目前科學家所使用的螢光蛋白，多半是由錢永健實驗室改造的GFP變體，讓科學家可以藉由在不同的蛋白質上做不同顏色的標定，來研究兩種以上蛋白質的變化與彼此之間的交互關係。
紅光比其他顏色更容易穿透組織，因此對於研究組織或是細胞特別有用。然而當時，一直無法將GFP 變種形成會散發紅色螢光的分子。後來Mikhail Matz與Sergei Lukyanov這兩位俄國科學家為這個難題提出初步的解決方案。他們從散發螢光的珊瑚中找到會發螢光的蛋白質，其中一種會發出紅色螢光，即DsRED。不過DsRED較大，具有4條胺基酸鏈，因此較不適合用作生物螢光標定。對此錢永健再度發揮他的專長，將DsRED改造成只要1條胺基酸鏈就可以發出紅色螢光的蛋白質，這個蛋白質較小並且較為穩定，所以非常適合作為生物螢光標定。往後錢永健又陸續發展出許多顏色綺麗的蛋白質，如mPlum、mCherry、mStrawberry、mOrange和mCitrine等。因此，拜錢永健所賜，細胞內原本單調的世界，頓時間散發出閃亮繽紛的色彩。
美國哈佛大學的研究者，將老鼠的中樞神經系統標定上4種不同的顏色——紅色、黃色、青綠色和橘色。在不同的細胞內，會有不同的蛋白質表現量，因此產生各種不同強度的螢光，藉由這些強度跟顏色各異的螢光組合，使得中樞神經系統形成千變萬化的色彩，又被稱為腦彩虹（brainbow）。藉由這樣的色彩變化，研究者就能清楚分辨原本交纏糾結而無法辨認的神經網路。

未完待續的華麗冒險
至今科學家仍在持續努力善用GFP，利用DNA基因工程的操作，許多變種GFP陸續被發展，以產生不同的顏色或者變得更穩定。GFP也可以做為一種探測器，用來偵測重金屬：將GFP基因接至會因感應到重金屬而啟動的啟動子之後，再轉殖到細菌之內，當細菌處在具有重金屬的環境中，便會產生綠色螢光。除此之外，將GFP嵌入早期的胚胎細胞內，可以產生具有螢光的動植物，如螢光老鼠和螢光豬。
台大動物科學技術學系吳信志老師的研究室，就有這兩種螢光動物。這些螢光基因轉殖動物，提供幹細胞再生醫學一個很好的辨識系統：將幹細胞轉殖入生物體後，經過誘導分化，幹細胞會形成特定的細胞，但是這樣就無法分辨出原本生物體內的細胞，與轉殖進去後分化成功的細胞，無法確知實驗是否成功。但是這些螢光動物的幹細胞，在分化前後都會表現綠色螢光，提供一個很好的標的，讓科學家去追蹤實驗結果。
另外，因為有了這些繽紛色彩，螢光動植物也被利用在商業方面，例如螢光寵物或是觀賞用螢光植物。但是這些基因轉殖動植物，還存在著基因工程安全與倫理的爭議：這些動植物是否願意被殖入螢光基因而發著綠光走在街頭上呢？但無論如何，GFP的發現與發展，的確讓科學家能藉由螢光標定，更了解生物體或細胞內生命的運作，也對疾病的產生跟治療有更進一步的認識。GFP在這方面的貢獻，是毋庸置疑的。

曖曖內含光─綠光的背後
偉大的成就都是許多人長期努力所累積而成，非一人一物一朝一夕可以達到。這次諾貝爾化學獎雖然頒給三位偉大的科學家，但在背後仍須許多人的努力付出，才能促成如此的成就。其中一位代表就是之前提到複製出GFP基因的普瑞舍。
普瑞舍是下村脩的同事，當他分離複製出GFP基因時，便發現到GFP的應用前景，可惜美國國家衛生研究院拒絕了他的研究申請，沒有研究經費的他只好放棄GFP的研究。當時他將GFP基因慷慨無償給予了馬丁．查爾菲與錢永健，因此才有後續的發展。馬丁．查爾菲也提到普瑞舍的偉大貢獻，並說他能獲獎其實應該感謝普瑞舍。普瑞舍後來離開學術界，當他知道GFP獲得諾貝爾獎的消息之後，也給予誠摯的祝福。儘管諾貝爾獎與普瑞舍可說是擦身而過，但相信樂觀與知足，就是生命饋贈他最好的獎賞。
在三位諾貝爾獎得主中，下村脩的歷程較不同於其他兩位：他做了將近二十年的博士後研究員，多年來沒沒無聞，雖然GFP已然如此廣泛地被運用在生物、生技與醫學的領域，但很多人卻不知道GFP最初的發現者是誰，或者是根本搞錯人。但是下村脩一路走來始終如一，他對自己的研究充滿熱誠，而且從中獲得至上的樂趣。
科學的基本精神本於純粹的求知，儘管這些人的研究在當時並沒有即時散發動人的光芒，但正因為這些基礎研究，才使得科學得以成長，也因為這些人的無悔付出，才能讓科學持續發光發亮。

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